Um dos principais atributos que conferem à semente uma alta qualidade é sua pureza genética, sendo a principal causa de contaminação em sementes de milho híbrido, a ocorrência de autofecundação do parental feminino. No entanto, ainda não existem metodologias seguras e rápidas para detectar tais contaminações. Desta forma, o presente trabalho foi desenvolvido objetivando certificar a pureza genética em sementes de milho híbrido por meio de diferentes técnicas de marcadores bioquímicos e de DNA. Sementes de dois híbridos e de suas respectivas linhagens, provenientes do programa de melhoramento da Universidade Federal de Lavras foram avaliadas por padrões eletroforéticos das isoenzimas álcool desidrogenase (ADH), esterase (EST), fosfatase ácida (ACP), glutamato-oxalacetato transaminase (GOT), malato desidrogenase (MDH), isocitrato desidrogenase (IDH), 6-fosfoglucamato desidrogenase (PGDH), fosfoglucomutase (PGM), catalase (CAT) e ß-glucosidade (ßGLU) e por marcadores microssatélites. Os sistemas enzimáticos que permitiram separar os híbridos de seus respectivos progenitores foram a catalase, a isocitrato desidrogenase e a esterase, sendo que para a esterase foi observada segregação mendeliana para o híbrido UFLA 8/3, o que torna a certificação da pureza genética mais segura. Os microssatélites além de terem sido eficientes na diferenciação dos híbridos e das linhagens parentais, apresentaram-se como uma técnica de análise rápida, precisa e independente do ambiente. Como o padrão de amplificação dos microssatélites não foi influenciado quando se utilizou o DNA extraído de sementes inteiras ou de folhas, torna-se possível a utilização de sementes como fonte de DNA, o que acelera e facilita a execução das análises de pureza genética.